細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)法（BET）依賴(lài)于鱟試劑來(lái)檢測(cè)和定量藥物及醫(yī)療器械中的細(xì)菌內(nèi)毒素，傳統(tǒng)上采用來(lái)自鱟變形細(xì)胞裂解物的天然鱟試劑。然而，隨著市場(chǎng)對(duì)重組試劑需求的增長(zhǎng)，以及針對(duì)天然鱟試劑存在的批次間差異、假陽(yáng)性結(jié)果風(fēng)險(xiǎn)及環(huán)境影響等問(wèn)題，新型重組級(jí)聯(lián)試劑應(yīng)運(yùn)而生。其中，PyroSmart NextGen®重組鱟試劑作為全-球-首-款完整的重組級(jí)聯(lián)試劑，為細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)帶來(lái)了革命性的改變。

一、PyroSmart NextGen®：革命性的重組級(jí)聯(lián)試劑

PyroSmart NextGen®重組鱟試劑由三種酶凝因子——重組因子C（rFC）、重組B因子（rFB）以及重組凝固酶原（rPCE）組成，這些因子均源自T. tridentatus的克隆基因。這一創(chuàng)新設(shè)計(jì)不僅解決了傳統(tǒng)天然鱟試劑存在的問(wèn)題，還顯著提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度。它的出現(xiàn)，標(biāo)志著細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)領(lǐng)域的一大進(jìn)步。

▲重組鱟試劑

二、卓-越的分析性能

根據(jù)ICH Q2指南和USP 1225標(biāo)準(zhǔn)，PyroSmart NextGen®重組鱟試劑經(jīng)過(guò)了嚴(yán)格的分析性能評(píng)估，包括準(zhǔn)確度、精確度、特異性、定量限、線(xiàn)性度和范圍等關(guān)鍵指標(biāo)，結(jié)果顯示，PyroSmart NextGen®重組鱟試劑方法驗(yàn)證的所有分析測(cè)試結(jié)果均符合驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，與天然鱟試劑相比，具有相當(dāng)?shù)募嫒菪院瓦m用性。

（1）優(yōu)異的線(xiàn)性表現(xiàn)：

所有標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)均達(dá)到了USP<85>中規(guī)定的計(jì)算相關(guān)系數(shù)驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)（|r|≥0.980），表明其檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期值高度一致（表1）。

▲表1.根據(jù)ICH Q2指南對(duì)PyroSmart NextGen®分析特性的評(píng)估

（2）高準(zhǔn)確性：

速率檢測(cè)和起始檢測(cè)的準(zhǔn)確性分別達(dá)到了84%至125%和71%至140%，均符合USP<85>的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)（50-200%），保證了檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

（3）重復(fù)性和中間精確度：

速率測(cè)定和起始測(cè)定的重復(fù)性分別在3%至21%和4%至30%之間，中間精確度的重復(fù)性也在7%至24%之間，均符合驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，表明檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，可重復(fù)性好。

（4）出色的重現(xiàn)性：

在不同批次或不同時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)中，速率測(cè)定和起始測(cè)定的可重復(fù)性分別在7%至17%和7%至22%之間，確保了檢測(cè)結(jié)果的一致性和可靠性。

（5）寬廣的檢測(cè)范圍：

在速率測(cè)定和起始測(cè)定中，檢測(cè)范圍分別覆蓋了0.00625至0.1EU/mL和0.005至50EU/mL，滿(mǎn)足了不同濃度內(nèi)毒素的檢測(cè)需求。

（6）定量限：

起始時(shí)間測(cè)定的定量限達(dá)到了最-低標(biāo)準(zhǔn)0.005EU/mL，且在此濃度下，準(zhǔn)確度和重復(fù)性均符合驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，表明該試劑對(duì)內(nèi)毒素的檢測(cè)具有很高的靈敏度。

（7）特異性高：

特異性高：在有(1→3)-β-D葡聚糖存在的情況下，該試劑不發(fā)生反應(yīng)，表明其具有很高的特異性，避免了因其他成分干擾而導(dǎo)致的誤檢。（圖2）

▲圖2. PyroSmart NextGen®在含有和不含有(1→3)-β-D葡聚糖時(shí)對(duì)內(nèi)毒素反應(yīng)性的回歸分析

上圖：速率測(cè)定，下圖：起始測(cè)定

三、應(yīng)用案例

（一）各種注射劑和散裝藥物中的內(nèi)毒素檢測(cè)

按照藥典中BET所描述的干擾因素測(cè)試程序進(jìn)行回收測(cè)試,檢測(cè)了各種注射藥物對(duì)PyroSmart NextGen®重組鱟試劑及其他重組試劑和天然鱟試劑反應(yīng)性的干擾。

此外，還測(cè)試了阿昔洛韋、胰島素、PBS和WFI。使用四種重組試劑和五種天然鱟試劑測(cè)量了內(nèi)毒素回收率。需要對(duì)PyroSmart NextGen®重組鱟試劑的起始時(shí)間測(cè)定進(jìn)行優(yōu)化，以便僅對(duì)肝素鈣中的內(nèi)毒素進(jìn)行適當(dāng)測(cè)定,最小無(wú)干擾稀釋因子 (NID) 如表2所示。

▲表2.用重組試劑和天然鱟試劑測(cè)試的注射藥物的非干擾稀釋倍數(shù)（NID）

PyroSmart NextGen®重組鱟試劑通過(guò)采用三因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)機(jī)制，提高了對(duì)于幽門(mén)螺桿菌GU2內(nèi)毒素的反應(yīng)性，速率測(cè)定比前代產(chǎn)品提升了9.5倍，起始時(shí)間測(cè)定則提升了4.4倍（圖1），并在檢測(cè)多種注射劑和散裝藥物中的內(nèi)毒素時(shí)，展現(xiàn)出了廣泛的應(yīng)用潛力，其最小無(wú)干擾稀釋因子（NID）優(yōu)于同類(lèi)產(chǎn)品，特別是在處理含有肝素鈣的樣本時(shí)表現(xiàn)更佳。

同時(shí)，相比天然鱟試劑和其他重組試劑，PyroSmart NextGen®重組鱟試劑在抑制和增強(qiáng)因子抗性方面表現(xiàn)出色，具備更高的敏感性。

▲圖1. 用四種重組試劑和五種天然鱟試劑測(cè)定的不同內(nèi)毒素的效力比較

（二）水和大腸桿菌O113:H10:K陰性培養(yǎng)上清液中的自生內(nèi)毒素檢測(cè) 

通過(guò)檢測(cè)水和大腸桿菌O113:H10:K陰性樣本的培養(yǎng)上清液中的自生內(nèi)毒素，評(píng)估了PyroSmart NextGen®重組鱟試劑與天然鱟試劑的可比性。（圖3和圖4）

結(jié)果顯示，該試劑在檢測(cè)這些樣品中的自生內(nèi)毒素時(shí)，展現(xiàn)出了與天然鱟試劑相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性和一致性，證明了其檢測(cè)能力可與天然鱟試劑相媲美。

▲圖3. 用四種重組試劑和五種天然鱟試劑測(cè)量的八個(gè)地方采集的去離子水中的自生內(nèi)毒素含量比較

▲圖4.使用四種重組試劑和五種天然鱟試劑對(duì)市售瓶裝水與大腸桿菌O113:H10:K (-)培養(yǎng)的上清液中的自生內(nèi)毒素水平的比較

四、總結(jié)

PyroSmart NextGen®重組鱟試劑不僅克服了傳統(tǒng)重組試劑的一些限制，還提供了與天然鱟試劑相當(dāng)甚至更優(yōu)的性能表現(xiàn)。隨著2025年5月美國(guó)藥典（USP）第<86>章“使用重組試劑的細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)試"的正式生效，這一先進(jìn)技術(shù)將在全球范圍內(nèi)得到廣泛采納。它為行業(yè)提供了一個(gè)更加可靠、環(huán)保的選擇，以支持更高質(zhì)量的安全標(biāo)準(zhǔn)。

未來(lái)，隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和應(yīng)用的深入拓展，PyroSmart NextGen®重組鱟試劑有望在細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用。